PCR實驗室入門級別的知識要點

一、PCR實驗室的設計原則
原則上應當設置4個區域：試劑儲存和準備區、標本製備區（qū）、擴增區、擴增產物分析（xī）區。
根據使用儀器的功能，區域（yù）可適當合並。
使用實時（shí）熒光PCR儀（yí），擴增區（qū）、擴增產物分析區可合並（bìng）；
采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本製備區、擴增（zēng）區、擴增產物分析區可合（hé）並。
各區功能準備物品清單：
1、試劑儲存和準備區（1區）
功（gōng）能：貯存試劑的製（zhì）備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心（xīn）管、吸頭等消（xiāo）耗品的貯存和準備。
準備物品：
（1）2～8℃和-20℃以下冰箱
（2）混勻器
（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
2、標（biāo）本製備區（2區）
功（gōng）能：核酸（RNA、DNA）提取（qǔ）、貯存及其加入至擴增反應管。對於涉及臨床樣（yàng）本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護（hù）和操作規範的要求。
準備物品（pǐn）：
（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱（xiāng）
（2）高（gāo）速離心機
（3）混勻器
（4）水浴箱或加（jiā）熱模塊
（5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
（6）生物安全櫃（guì）。
3、擴增區（3區）
功能：cDNA合成、DNA擴增及檢測。
準（zhǔn）備物品（pǐn）：核酸擴增儀（或熒光定量PCR儀）
4、擴增產物分析區（qū）（4區）
功（gōng）能：擴增片段（duàn）的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
準備物品：
（1）雜交（jiāo）儀、電泳（yǒng）儀、測序儀等
（2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000µl）
通用物品：（4個區都有（yǒu）可能需要）
（1）可移動紫外燈（近工作台麵）
（2）消耗品：一次性（xìng）手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（tóu）
（3）專（zhuān）用工作（zuò）服和工作鞋（xié）(套)
（4）專用辦公用品
（5）樣本管架（2區）
（6）防爆夾（2區）
（7）PCR管架（2區、傳遞窗）
二、PCR實驗室工作基本原則
1、進入各工作區域應當嚴格按照（zhào）單一方（fāng）向進行（háng）
試劑儲存和準備區→標本製備（bèi）區→擴（kuò）增區→ 擴增產物分析（xī）區。
2、各工作區域必須有明確的標記，不同工作區域內的設備、物品不得混用。
3、不同的（de）工作區域使用不同的工作（zuò）服（例如不同的顏色）。工（gōng）作人員離開各工作區域時，不得將工作服（fú）帶出。
4、實驗室的清潔應當按試劑貯存和準備區→標本製備（bèi）區→擴增區→擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉汙染。
5、工作結束後，必須立即對工作區進行清潔。工作區的實驗台表麵應當可耐受諸如次氯酸鈉的化學（xué）物質的消毒（dú）清（qīng）潔作用。實驗（yàn）台表麵的紫外照射應當方便有效。由於紫外照射的距（jù）離和能量對去汙染的效果（guǒ）非常關鍵，因此可使用可移動紫（zǐ）外燈（254nm波長），在工作完成後調至實（shí）驗台上60～90cm內照射。由於擴增產物僅幾百或幾十（shí）堿基對（bp），對紫外線損傷不敏（mǐn）感，因（yīn）此紫外照射擴（kuò）增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。
6、實驗室的安全（quán）工作製度或安全標準操作程序，所有操作（zuò）符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。
三、注意事項
1、試劑儲存和準備區
貯（zhù）存試劑和用於標本製備的消耗品等材料（liào）應當直接運送至試劑貯存和準備區，不能經過擴增檢測區，試劑盒中的陽性對照品（pǐn）及質控品不（bú）應當保（bǎo）存在（zài）該區，應（yīng）當保存在標本處理區。
2、標本製備區
由於（yú）在樣本混合、核（hé）酸純化過程中可能會發生氣溶膠所致的汙（wū）染，可通過在本（běn）區內設立正壓條件，避免從鄰近區進入本區的氣溶膠汙染。為避免樣本間的（de）交叉汙（wū）染，加入待測核酸後，必須蓋好含反應（yīng）混合液的反應管。對具有（yǒu）潛在（zài）傳染危險性的材料，必須在生物安（ān）全櫃（guì）內開蓋，並有明確的樣本處理和滅活程序。
3、擴增區
為（wéi）避免氣溶膠（jiāo）所致的汙染，應當盡量減少在本區內的走動。必須注意的是（shì），所有經過檢測的反應管不得在此區域打開。
4、擴增產物分析區
核酸擴增後產物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯（xīn）片上探針（zhēn）雜交方法（fǎ）（放射性核素標記或非放射性核（hé）素標（biāo）記）、直接或酶切後瓊（qióng）脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法、質譜分析等。本區是最主要的擴增產物汙染來源，因此必須注意避（bì）免通過（guò）本區的（de）物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法（fǎ）檢測擴增產物（wù）時，必須（xū）使用（yòng）洗板機洗板，廢（fèi）液必須收集至1 mol/L HCl中（zhōng），並且不能在（zài）實驗（yàn）室內傾倒，而應當至遠離PCR實驗室（shì）的地方棄掉。用過的（de）吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸（jìn）泡後（hòu）再放到垃圾袋中按程序處理，如焚（fén）燒。由於本區有可能會用到某些可致基因突（tū）變和（hé）有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性（xìng）核素等，故應當注意實驗（yàn）人員的安全防護。